الكائنات الدقيقة

المصادر العلمية والمهنية للموضوع




AOAC Official Method 966.24



SECOND EDITIONHANDBOOK OF WATER ANALYSIS



MANUALMANUAL OF MICROBIOLOGICAL CULTURE MEDIA DIFCO & BBL



Practical Food Microbiology



BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology Second Edition



Iso 4831/1991 and Iso 7251/2005


الشريك، ي.م - تقنية اللحوم – منشورات جامع الفاتح – طرابلس
المنلا ، ع الرقابة الصحية للحوم والأسماك ومنتجاتـها – منشورات جامعة البعث- كلية الطب البيطري – العراق






ملحوظة هامة جدا للكشف عن الكولي فورم بشكل عام بغرض تكنولوجي يتم التحضين على درجة 30 co



أما أذا كان للصحة العامة فيجب التحضين على 37 co أما الأشريشيا كولاي فتكون درجة التحضين 44 co وفي بعض المراجع 44.5 co: 45.5co







أي بيئة لابد أن يتوافر بـها مصدر للنتروجين والاحماض الامينية الاساسية والفيتامينات والاملاح المعدنية ومصدر للكربون والطاقة وقد تضاف مواد لضبط الضغط الاسموزي و أخري تعمل كبفر وفي حالة البيأت المتخصصة قد تضاف مادة لمنع نمو مجموعة دون الاخري وقد تضاف أيضا مواد للتفرقة بين ميتابوليزم عدة أجناس







أولا : ملخص لبعض المديات المستخدمة في الكشف عن الكوليفورم البرازية والايكولاي



والتى يعتبر وجودها مؤشر للتلوث البرازي وأنخفاض الهيجين بالمنتج وخلل خطير بنظام الجودة








بيئة مرق ماكونكي MACCONKEY BROTH







تستخدم عادة في إجراء للأختبار الأحتمالي presumptive test لمجموعة الكولي فورم fecal coliform ، والتي تتميز بأنـها عصوية bacilli ،سالبة لصبغة جرام gramnegative،مـخمرة لسكر الاكتوزlactosefermenting كمصدر وحيد للطاقة .




Difco™MacConkey Broth






Oxgall ................................... ................................... ... 5.0 g



Peptone ................................... ................................ 20.0 g



Lactose ................................... ................................. 10.0 g



Bromcresol Purple ................................... ................. 0.01 g




وتقدم هذة البيئة الببتون Peptone كمصدر أساسي للنيتروجين وللأحماض الامينية amino acids والمواد الاساسية للنمو كالفيتامينات والاملاح المعدنية ، والاكتوز Lactose كمصدر وحيدالكربون و الطاقة ، مما يسمح بنمو العصويات السالبة لجرام دون غيرها ،ويعزز ذلك إضافة Oxgall صفراء الثوركمادة مثبطةinhibits لنمو البكتريا الموجبة لجرام ويضاف الBromcresol Purple كدليل لوني للبيئة بتغير ال ph وأنتاج الأحماض من اللون الوردي الزاهي الي اللون الاصفر الباهت ،ومع وجود أنبوبة درهام مما يظهر بوضوح عملية أنتاج الغاز.مرق الاكتوز Lactose Broth



وهي بيئة غير متخصصة تستخدم في الغالب في مرحلة pre-enrichment و تعطي الفرصة الكاملة لنمو السالمونيلا salmonellae و البكتريا المخمرة للاكتوز بشكل عام لذ سوف نتوقف بـها عند هذا الحد.

Difco™ Lactose Broth

Beef Extract ................................... ............................ 3.0 g

Peptone ................................... .................................. 5.0 g

Lactose ................................... ................................... 5.0 g









مرق لوريال سلفات التربتوز (LST) Lauryl Tryptose Broth



تستخدم هذة البيئة بشكل كبير في إجراء للأختبار الأحتمالي presumptive test لبكتريا القولون والايكولاي بطريقة (mpn) عند درجات حرارة تتراوح من 30co: 37 co حسب الغرض المطلوب من الاختبار .

Difco™ Lauryl Tryptose Broth

Tryptose ................................... . ...................... ......20.0 g

Lactose ................................... . ............................... 5.0 g

Dipotassium Phosphate ........... .............................. 2.75 g

Monopotassium Phosphate .... ............................... 2.75 g

Sodium Chloride .......... ................................... . ...... 5.0 g

Sodium Lauryl Sulfate ................................... ............. 0.1 g





حيث يمد التربتوز البيئة بالمواد الأساسية للنمو كالنيتروجين و الفيتامينات و..... ، و الاكتوز يعتبر مصدر الكربون والطاقة الوحيد القابل للتخمر وفوسفات البوتاسيوم كبفر، وكلوريد الصوديوم كضابط للضغط الاسموزي ،واللوريال سلفات تضاف كمادة مانعة لنمو أي نوع بكتيري خلاف الكولي فورم،ويعتبر أي تغير في درجة الشفافية أو وجود عكارة أو ظهور غاز في أنابيب درهام نتيجة موجبة للأختبار.



مرق الاكتوز والصفراء مع الأخضر الامع2% Brilliant Green Bile Broth 2%

تستخدم هذة البيئة كأختبار تأكيدي في طريقة ال(mpn) للكشف عن الكولي فورم وتحتوي البيئة على Oxgallو ال Brilliant Green كمادتين مثبطتين لنمو البكتريا الموجبة لجرام



Difco™ Brilliant Green Bile Broth 2%



Peptone ................................... ................................ 10.0 g

Oxgall ................................... ................................... . 20.0 g

Lactose ................................... ................................. 10.0 g

Brilliant Green ................................... ..................... 13.3 mg



وتتميز البيئة باللون الاخضر ويعتبرأي تغير في الشفافية أو وجود عكارة أو غاز في أنابيب درهام نتيجة موجبة للأختبار





مرق بيئة الإيكولاي EC Medium



Difco™ EC Medium

Tryptose ................................... ................................ 20.0 g

Lactose ................................... ................................... . 5.0 g

Bile Salts No. 3 ................................... ........................ 1.5 g

Dipotassium Phosphate ................................... ........... 4.0 g

Monopotassium Phosphate ....................... ................. 1.5 g

Sodium Chloride ....................... ................ ................. 5.0 g



طبعا نفس الكلام السابق مع وجود Bile Salts لمنع نمو البكتريا موجبة لصبغة جرام لكن الفرق أنه يتم التحضين علي 44.5 ويكون لون البيئة أصفر شفاف و وجود عكارة أو غاز في أنابيب درهام نتيجة موجبة للأختبار



Difco™ EC Medium with MUG

Tryptose ................................... ................................ 20.0 g

Lactose ................................... ................................... . 5.0 g

Bile Salts No. 3 ................................... ........................ 1.5 g

Dipotassium Phosphate ................................... ........... 4.0 g

Monopotassium Phosphate ................................... ..... 1.5 g

Sodium Chloride ................................... .............. ....... 5.0 g

MUG (4-methylumbelliferyl-â-D-glucuronide) .......... 0.05 g



كما نلاحظ الفرق الوحيد هو أضافة MUG (4-methylumbelliferyl-â-D-glucuronide) حيث أن الايكولاي تنتج أنزيم glucuronidase والذي يقوم بعملية hydrolyzes لل MUGلناتج فلورسنتي يظهر بوضوح تحت long-wave (366 nm) UV lightوأختيار البيأت يرجع للــطريقة المستعملة وإمكانيات المختبر

طبعا هناك العديد من البيأت الأخري لكن سنكتفي بـهذا القدر







بعض المعلومات الاساسية العامة عن

Family : enterobacteriaceae

1- عصويات –سالبة لصبغة جرام – غير مكونة للجراثيم

2- غير متجانسة التخمر – تخمر الاكتوز تكون أحماض ومجموعة من المركبات الكربونية المتعادلة – تنتج غاز

Co2,H

3- لا هوائية أختيارية







بعض الملاحظات التكنولوجية عن E.COLI

1- قد تسبب بعض النزلات المعوية لدي الاطفال

2- سريعة في تخمير الاكتوز مما قد يسبب طفو الخثرة في الجبن أو قد تسبب الانتفاخ المبكر في الجبن الجودا والايدام وفي حالة الاصابة الشديدة تكسب الخثرة قوام أسفنجي الحدود الحرارية لها من 5: 47 والمثلي 37 والبسترة قد تقضي عليها تما ما إلا ان هناك بعض الانوا المقاومة للحرارة

3- يسبب ورائح غير نظيفة وعادة تشبة رائحة البراز بسبب أنتاج مركبات الاندول ومركبات أخري عديدة

4- تحلل البروتين لكن بشكل ضعيف

5- يفرق بينها وبين الانتيرو باكتر بواسطة أختبار إيخمان حيث ينتج غاز من تخمر الاكتوز عند 44.5







التالي1- بعض الاختبارات الكيمو حيوية المستخدمة في التـفريق والتصنيف

G-IMVIC

2- خطوات أجراء طريقة (mpn) العدد الاكثر احتمال
2- أستخدام التفاعلات الكيمو حيوية للتعرف علي وتصنيف البكتريا





G-IMVIC



أولا : أختبار تكوين الاندول


هو قياس قدرة البكتريا المعزولة تكوين الأندول indol من تكسيرالحمض الأميني التربتوفان tryptophan بواسطة أنزيم tryptophanase منتجة حامض البيروفك و الامونيا والاندول كنواتج التمثيل ويكشف عنة بواسطة Kovac’s reagent .



طريقة الاجراء

Inoculate the tryptophan (or peptone) broth with the test organism (loop full) and incubate at 37°C for 24-28 hours
Add 0.5 mL of the Kovac’s reagent and gently agitate
Examine the upper layer of liquid



Positive result red colour (occurring within a few seconds)


Negative result yellow colour

http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Johnson/images/INDOLE%20Enterobacter%20Escherichia %20coli%20fig1.jpg




Escherichia coli (indole positive)


Klebsiella oxytoca (indole positive)


Klebsiella or Enterobacter bacteria (indole negative)



هذا الاختبار يجري للتأكد من الأشريشيا كولاي في نهاية طريقة العدد الاكثر أحتمال


ملحوظة هامة بعض أجناس الايكولاي لا تعطي نتيجة موجبة لذا لابد من أجراء باقي الاختبارات معمليا أو عموما هي متوافرة في شريحة API 20Eوالتي سوف أفصل فيها فيما بعد

ثالثا : أختبار أحمر الميثيل و أختبار فوكس بروسكاور

Methyl Red / Voges-Proskauer (MR/VP)





( M - Vi )





BBL™ MR-VP Broth



Pancreatic Digest of Casein ................................... ..... 3.5 g

Peptic Digest of Animal Tissue ................................... 3.5 g

Potassium Phosphate ................................... .............. 5.0 g

Dextrose ................................... .................................. 5.0 g



Difco™ MR-VP Medium



Buffered Peptone ................................... .................... 7.0 g

Dipotassium Phosphate ................................... ........... 5.0 g

Dextrose ................................... .................................. 5.0 g





وهما يجريان لأختبار أختبار سلوك البكتريا المعزولة في تمثيل الكربو هيدرات مثل الجلوكوز أو الدكستروز والتى تتميز الى مجموعتين الاولي تنتج كمية كبيرة ومختلطة ناتجة عن التخمر mixed acid fermentation من حامض الاكتيك lactic و الاستيك aceticوالسكسنيك succinic والفورميك formic و غاز مثل H , Co2 والكحول ، وهذة الكمية من الاحماض تتغلب علي المحلول البفر وتوصل الph الي 4.4 وبوضع أحمر الميثيل كدليل لوني تتلون العينة بالون الأحمر كنتيجة موجبة ،أ ما لوكان ال ph قريب للتعادل ولم يصل لهذا الحد فالون الاصفر دليل علي سلبية الاختبار ويعني ذلك ايضا نة لم يتجاوز قيمة ال 6 ph .



و الثانية تنتج أحماض بكميات طفيفة جدا ولكنها تصل بالميتابولزم النهائي الي 2,3
butanediol و acetone و بوضع كمية محسوبة من الدليلين alpha-napthol الموجود في Barritts reagent a و potassium hydroxide الموجود في Barritts reagent b والخلط الجيد لمساعدة الاكسجين في التخلل يظهر اللون الاحمر في البيئة كنتيجة موجبة أما إذا كانت النتيجة سالبة فاللون يكون الون brownish-green to yellow وقد يستغرق هذا الاختبار ساعة كحد أعلى.


طريقة الاختبار
1- inoculate tubes of MR-VP media or broth with an a loop full pure cultures to 18- to 24-hour aerobically at 35 ± 2°C for a minimum of 48 hours .
2- Prepare the methyl red indicator by dissolving 0.1 g of methyl red in 300 mL of 95% ethyl alcohol. Add sufficient purified water to make 500 mL. After the appropriate incubation period, aseptically remove aliquots (1 mL for the VP test) of the medium and conduct the following tests:
1. Methyl Red Test – Add 5 drops of methyl red indicator to an aliquot of the broth. Interpret the color result immediately.
2. Voges-Proskauer Test – Empty the contents (15 drops) from the reagent A dropper and 5 drops from the reagent B dropper into 1 mL of broth culture. Shake well after the addition of each reagent to aerate the sample.


















http://users.stlcc.edu/kkiser/MR.jpg


http://users.stlcc.edu/kkiser/VP.jpg


Escherichia coli ………………….. (MR positive) (VP negative)

Klebsiella pneumoniae .................(MR negative) ( VP positive )

Enterbacter aerogenes…………... (MR negative) ( VP positive )

رابعا : أختبار أ ستخدام السيتريت


Citrate Utilization




( C )


وهذا الاختبار يستعمل لتحديد قدرة البكتريا المعزولة على أستخدام الستريت citrateالموجود في ستريت الصوديومsodium citrate كمصدر وحيد للكربون والطاقة وتحويلة الى oxaloacetate خلال دورة كربسKreb’s cycle والامونيا ammonium كمصدر وحيد للنتروجين مما ينتج عنه صعود الph ناحية القلوية وتلون الدليل Bromthymol Blue من اللون الاخضر العادي الى الازرق القلوي كنتيجة موجبة للأختبار






BBL™ Simmons Citrate Agar




Ammonium Dihydrogen Phosphate ........................... 1.0 g


Dipotassium Phosphate ................................... ........... 1.0 g


Sodium Chloride ................................... ..................... 5.0 g


Sodium Citrate ................................... ........................ 2.0 g


Magnesium Sulfate ................................... ................. 0.2 g


Agar ................................... ................................... ... 15.0 g


Bromthymol Blue ................................... .................... 0.08 g




http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Atlas_Citrate/Citrate%203.jpg


طريقة الاجراء


Inoculate slants with growth or loop full from a pure culture for 4 days at 35 ±2°C in a aerobic atmosphere.










Escherichia coli ……………………..……………... ( - )


Klebsiella pneumoniae ….................................. ..... .( + )


Enterbacter aerogenes…………………….………... ( + )


Shigella flexneri…………..……… ... (Complete inhibition)