الدروس العملية فى مجال التكاثر الخضرى بزراعة الأنسجة

frid

frid

عدد المساهمات : 1210
تاريخ التسجيل : 08/10/2010

10- الدروس العملية فى مجال التكاثر الخضرى بزراعة الأنسجة

أ – تكاثر الدخان بنسيج النخاع البرانشيمى Propagation of Tobacco pith parenchyma in vitro

ب - التكاثر الخضرى للأوركيد Vegetative propagation of orchids

جـ - عزل وزراعة القمة النامية للقرنفل Isolation and culture of the shoot tip of carnation

د - زراعة القمة النامية لنبات الفيكس Ficus shoot tip culture for rapid clonal propagation

هـ- زراعة الورد بطريقة زراعة الأنسجة Rapid propagation of roses in vitro

و - التكاثر الخضرى للموالح باستخدام أنسجة الكلس الجسمية Clonal propagation of citrus from somatic callus

ز - إكثار النخيل بزراعة الأنسجة Propagation of date palm (phoenix dactylifa L) in vitro

ح - التكاثر السريع للموز باستخدام القمة النامية Rapid multiplication of Banana by in vitro shoot tip culture

ط - تكاثر التفاح بزراعة الأنسجة Propagation of apple by tissue culture

ك - تخليق النموات الخضرية للبيكان عند زراعة أنسجتها In vitro proliferation of pecan shoots

ل - التكاثر الخضرى السريع للأسبرجس باستخدام البراعم الجانبية Rapid vegetative propagation of Asparagus through lateral bud culture

م - زراعة القمة النامية للطماطم Apical shoot tip culture of tomato

ن - تكاثر البطيخ معملياً In vitro propagation of watermelon

ش - تكاثر الثوم بزراعة الأنسجة Propagation of Garlic tissue culture

--------------------------------------------------------------------------------

أ – تكاثر الدخان بنسيج النخاع البرانشيمى Propagation of Tobacco pith parenchyma in vitro

عديد من الخلايا النباتية لها القدرة على تخليق الأعضاء مثل الجذور والنموات الخضرية والأجنة والنبات الكامل وهى ما تعرف بالقدرة الذاتية على التخليق المورفولوجى أو القدرة الوراثية Morphogenetic capabilities of plant cell , وهذه القدرة ينظمها المستوى الهرمونى الداخلى للنبات متعاوناً مع المستوى الهرمونى فى البيئة الغذائية عند زراعة النسيج النباتى Explant وكمثال على ذلك ما وجدSkoog & Miller 1957 من أن التوازن الهرمونى بين الأوكسين والسيتوكينين هو المحدد لطبيعة التخليق . ونسوق ذلك المثال لتكاثر الدخان باستخدام نسيج النخاع البرانشيمى.

الأدوات المستخدمة The equipment :

· أنابيب اختبار (25×150 مل ) تحتوى على بيئة MS .

· أربع دوارق مخروطية تحتوى على ماء مقطر معقم.

· 40 قطعة من ورق الترشيح (200×200 مل ).

· 10 أطباق بترى معقمة فى الفرن على 180 دم لمدة ساعتين.

· قطع من أوراق الألمونيوم المعقمة (100 × 100 مل ).

· ملقط طويل 150 مل.

· مشارط بسلاح رقم 11.

· نباتات دخان عمرها 1-8 أسابيع بطول 1 متر تقريباً.

· 3 حوامل أنابيب.

· دورق مخروطى يحتوى على كحول ايثانول 70 %.

· دورق مخروطى يحتوى على محلول صوديوم هيبوكلوريد 20 % وحضر من محلول الكلوركس التجارى (جزء لكل 5 اجزاء ماء ).

· قلم للتعليم Waterproof marking pen .

· ثاقب فلينى Cork borer ذو قطر مناسب لأخذ العينات من نخاع النبات .

· موقد كحولى.

· ملقط معقم.

· دورق مخروطى يحتوى على كحول ايثانول 95 %.

البيئـــة The media

تتكون البيئة الغذائية لـ DAUC على الأملاح الآتية:

- COCl2.5H2O 0.025 mg/l

- CaCl2.2H2O 440 mg/l

- FeSO4.7H2O 27.2 mg/l

- CuSO4.5H2O 0.025 mg/l

- KH2PO4 170 mg/l

- H3BO3 6.200 mg/l

- KI 0.230 mg/l

- KNO3 1900 mg/l

- MgSO4.6H2O 370 mg/l

- MnSO4.4H2O 22.3 mg/l

- NaEDTA 37.3 mg/l

- Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/l

- NH4NO3 16500 mg/l

- ZnSO4.7H2O 8.6 mg/l

بالإضافة إلى:

- Sucrose 4%

- Nicotinic acid 1.0 mg/l

- Pyrodoxin HCl 0.2 mg/l

- Thiamin HCl 0.2 mg/l

- Casin hydrolysate 500 mg/l

- Agar 0.8 mg/l

ويضاف الأوكسين بتركيزات تتراوح بين 0.02 – 3.0 mg/l فى صورة IAA كذلك الكينيتين بتركيزات 0.2 – 0.3 mg/l .

أعلى الصفحة

النسيج المستخدم Explant

تقطع القمة الطرفية للفرع بطول 3 سم وتنزع منها الأوراق والبراعم الجانبية حتى نحصل على عقل صغيرة يقطع من قاعدة تلك العقل 1 سم وتغمس فى شمع سائل ثم تعقم تلك الأجزاء بالطرق التقليدية وتغسل بعد ذلك عدة مرات بماء مقطر معقم وتجفف على ورق ترشيح وتنقل إلى كابينة العزل لعزل نسيج النخاع البرانشيمى.

الإجراءات Precedures :

1. تعقم العقل السابقة مرة أخرى بالطرق التقليدية بغمسها فى كحول ايثايل 70 % لمدة 5 دقائق يتبعها الغمس فى محلول الصوديوم هيبوكلوريد 20 % لمدة 15 دقيقة ثم تغسل بالماء عدة مرات.

2. تقطع العقل على أجزاء صغيرة أو شرائح صغيرة.

3. باستعمال الثاقب الفلينى المعقم يتم انتزاع النسيج البرانشيمى للنخاع بحيث لا يزيد سمك تلك القطاعات عن 2-3 مم ثم تنقل إلى سطح البيئة حيث كل أنبوبه تحتوى على عدد 2 Explant تعقم فوهة الأنابيب بإمرارها على اللهب ثم تغطى بورق الألمونيوم أو أغطية من البولى اثيلين .

4. تحضن الأنابيب على درجة حرارة 25-27 م وإضاءة قدرها 2000 Lux لمدة 16 ساعة فى اليوم.

أخذ النتائج Recording of result :

دون مشاهداتك من حيث تكوين الكالس وتخليق النموات الخضرية والجذرية فى الجدول التالى

Treatment
No of culture tube
Kinetin mg/l
IAA mg/l

A
10
0
0

B
10
0
0.2

C
10
0.2
0

D
10
0.2
3.0

E
10
3.0
0.2

F
10
3.0
0.02

كذلك سجل فى جدول خطوات العمل ومواعيد وبداية العمل

-Timing

-Days

-Beginning of proliferation

-Callus formation

-Transfer of the callus

أعلى الصفحة

ب - التكاثر الخضرى للأوركيد Vegetative propagation of orchids

هذه التجربة مثال للاستخدام تكنيك زراعة الأنسجة كوسيلة من وسائل التكاثر الخضرى فى نباتات أحادية الفلقة وهو من النباتات صعبة الإكثار خضرياً كما هو معروف مقارنتاً بالنباتات ثنائية الفلقة ويستخدم فى التكاثر هنا الأنسجة المرستيمية المأخوذة من كور مات الأوركيد وتزرع على بيئة بسيطة تحتوى على فيتامين ب.

الأدوات المستخدمة The equipment

· أنابيب اختبار (25 – 120 مم ) تحتوى على 10 سم من بيئة الآجار المائلة بزاوية 25.

· 20 قطعة من ورق الترشيح ( 200 × 200 ءمم ).

· دوارق مخروطية (25 مل ) ذات غطاء من ورق الألمونيوم تحتوى 200 مل من الماء المقطر.

· أطباق بترى ذات قطر 50 مل.

· 10 قطع من أوراق الألمونيوم (100 × 100 ).

· ملقط ( 120 – 150 سم ).

· 2مشرط (120 سم ) ذو سلاح نمرة 11.

· درنات الأوركيد Bulb of cymbidium .

· حامل الأنابيب.

· كأس زجاجى (250 مل ) تحتوى على 200 مل من محلول كلوركس 20 % مضاف إليه نقطتين من مادة ناشرة مثل Tween 20 .

· كأس (250 مل ) يحتوى على 200 مل كحول الايثانول 95 %.

· قلم تعليم Waterproof marking pen .

· ميكروسكوب.

· ملقط ذو حافة حادة.

· موقد كحولى أو بنزن.

· دورق مخروطى يحتوى على 100 مل كحول 95 %.

البيئــــة The media

تتكون البيئة الغذائية على أملاح Murashige & Skoog 1962 بالإضافة إلى

Sucrose
2 %

Nicotinic acid
0.5 mg/l

Pyrodoxin HCl
0.1 mg/l

Thiamin HCl
0.1 mg/l

Glycine
3.0 mg/l

Agar
0.8 mg/l

يتم ضبط PH على 5.8 ثم تعقم البيئة على درجة 121 ( 15 دقيقة ) .

الجزء المستعمل فى الزراعة Explant :

يتم نزع البصيلات الكاذبة Pseudobulbs من النبات ثم يفصل باحتراس كل الأوراق القديمة حتى نحصل على البصيلة كما فى الشكل ويكون المرستيم ما زال مغطى ببعض الأوراق الصغيرة انزع البرعم الجانبى Side bud بالمشرط واغمسها فى الكحول 95 % لمدة 5 ثوانى وانزعها وهزها حتى نتخلص من الكحول ثم اغمسها فى محلول هيبوكلوريد الصوديوم لمدة 25 دقيقة. انقل الأنسجة المعقمة داخل غرفة العزل Hood فى ماء مقطر بعد غسلها ثلاث مرات للتخلص من أثار الهيبوكلوريد .

الإجراءات Precedures

1. بعد نقل البراعم إلى داخل كابينة العزل نضع كل برعم فى طبق بترى وبعناية ننزع الأوراق الصغيرة الحرشفية.

2. تغمس البراعم فى كحول ايثايل 95 % وتشطف 2-3 مرات بالماء المقطر المعقم ونترك مع كل برعم 2-3 مبادئ الأوراق Leaf primordial بالإضافة إلى المرستيم ويتم ذلك العزل تحت الميكروسكوب وبواسطة مشرط حاد معقم بغمسه فى الكحول وحرقه على اللهب.

3. ينقل المرستيم إلى سطح البيئة وتحضن الأنابيب على درجة 25 م +2 وإضاءة قدرها 2000 Lux .

4. بعد 8 أيام سوف يتحول لون المرستيم إلى اللون الأخضر يترك أسبوعين آخرين حتى تتكون الكورمه والتى تقسم إلى 4-6 قطع باستخدام مشرط حاد وتنقل الأجزاء المقطوعة على بيئة جديدة لها نفس التركيبة السابقة. وتعقم فوهة الأنابيب وتغلق باستعمال سدادات من ورق الألمونيوم.

5. سرعان ما تتطور كل جزء مزروع إلى Prorocorm جديد.

أخذ النتائج Recording of result

سجل النتائج والملاحظات ونسبة النجاح فى المواعيد التى يبينها الجدول التالى

ملاحظات
نسبة النجاح
اليوم
تنقل النباتات لأرض المشتل . النتائج

عزل المرستيم

تحول المرستيم إلى اللون الأخضر

تكون الـ Protocorm

تقسيم الـ Protocorm إلى 4-6 أجزاء وزراعتها

اكتمال تكون الكورمات

أعلى الصفحة

جـ - عزل وزراعة القمة النامية للقرنفل Isolation and culture of the shoot tip of carnation

تستخدم زراعة القمم النامية لإنتاج أعداد كبيرة من النباتات فى حالة الرغبة فى استخدام ذلك التكنيك كوسيلة للتكاثر الخضرى مما يؤدى إلى خفض تكاليف إنتاج بعض النباتات الغالية الثمن أو التى يكون هناك صعوبة فى إكثارها كما يستخدم ذلك التكنيك للحصول على نباتات خالية من الفيروس كما فى النارجس والداليا والفراولة.

الأدوات المستخدمة The equipment

· أنابيب اختبار تحتوى على البيئة الغذائية المائلة بدرجة 25 م.

· عقل طرفية من القرنفل.

· زوج من الملاقط (120 سم).

· مشرط ذو سلاح حاد رقم 11.

· ميكروسكوب.

· ثلاثة أطباق معقمة.

· ثلاثة كاسات ( 250 مل ) يحتوى كل منهما على 200 مل ماء مقطر معقم للغسيل.

· كحول 70 %.

محلول هيبوكلوريد الصوديوم 20 %.

الجزء المستعمل فى الزراعة Explant :

تستعمل القمة النامية للنباتات ويمكن الحصول عليها بعد نقع عقل نباتات القرنفل وتعقيمها سطحياً بالكحول 70 % لمدة دقائق ثم غسلها بالماء ونقلها إلى كابينة العزل.

البيئـــــة The media :

يستخدم بيئة الآجار والتى تتكون من أملاح Murashige and Skoog بالإضافة إلى الآتى :

3 % Sucrose

Thiamin HCl
0.4 mg/l

Inositol
100 mg/l

IAA
0.3 mg/l

Kinetin
1.0 mg/l

Agar
0.2%

يضبط الـ PH على 5.7 ثم يضاف الآجار ويوزع على الأنابيب 25 × 150 مل بواقع 20 مل لكل أنبوبه ثم تغطى الأنابيب باستعمال أغطية من الـ Polyproplene .

الإجراءات Procedures

1. تنزع الأوراق الكبيرة من على عقل القرنفل ثم يأخذ الجزء الطرفى بطول0.5 بوصه والتى تعقم فى الكحول لمدة 5 دقائق ثم ينقل إلى كأس به محلول هيبوكلوريد الصوديوم 20 % ويغسل بالماء عدة مرات.

2. يتم تحت الميكروسكوب وباستخدام المشرط نزع الأوراق وتترك فقط زوج من مبادئ الأوراق Primordial Leaf بالإضافة للقمه النامية.

3. تنقل القمة النامية لسطح البيئة وتعقم فوهة الأنابيب على اللهب وتغطى

4. تحضن الأنابيب على درجة 25 م وإضاءة 100 شمعه / قدم

5. بعد 3-4 أسابيع عندما تكون النموات الخضرية طولها بوصه تنقل على سطح بيئة جديدة لا تحتوى على كلاً من الأوكسين والستوكينين مع زيادة شدة الإضاءة إلى 1000 Lux فتتكون الجذور بعد 4 أسابيع أخرى ثم يتم نقل النباتات المتكونة إلى أصص تحتوى على مخلوط زراعى معقم وتنقل تحت Mist حتى تتأقلم.

جدول العمل

· عزل القمة النامية وزراعتها على بيئة Murashige and Skoog مع IAA 0.3 + Kn 1.0 ppm .

· نقل النموات الخضرية المتكونة على البيئة السابقة الخالية من الهرمونات .

· نقل النباتات المتكونة داخل أصص بلاستيك تحت Mist أو تغطى بكأس داخل حضانة على نفس الإضاءة والحرارة.

أعلى الصفحة

د - زراعة القمة النامية لنبات الفيكس Ficus shoot tip culture for rapid clonal propagation

يستخدم تكنيك زراعة الأنسجة فى إنتاج أعداد كبيرة من نبات الفيكس باستخدام القمة النامية مما يؤدى إلى خفض تكلفة إنتاج النباتات مقارنتاً بالطرق التقليدية.

الأدوات المستخدمة The equipment

1. أنابيب اختبار تحتوى على بيئة M & S مائلة بدرجة 25 م.

2. عقل من نبات الفيكس.

3. ملقط صغير وآخر طويل.

4. مشرط ذو سلاح حاد رقم 11.

5. أطباق بترى معقمة.

6. ميكروسكوب مزود بإضاءة.

7. كحول ايثانول 70 %.

8. كحول 20 % من صوديوم هيبوكلوريد.

النسيج المستخدم Explant :

القمة النامية المأخوذة من العقل الطرفية لنبات الفيكس.

البيئـــة The media :

تستخدم بيئة أجار M & S بالإضافة إلى

3 % Sucrose

Inositol
100 mg/l

Thiamin HCl
0.4 mg/l

IAA
0.3 mg/l

6-isopentenyl adenine
30 mg/l

Agar
0.8%

يضبط الـ PH على 5.7 +- 1 ويذاب الأجار ويعبأ فى أنابيب وتعقم على درجة 121 لمدة 15 دقيقة.

الإجراءات Procedures :

1. افصل واحد وأكثر من الأوراق الغمدية حول قمة الساق الساكن حتى تصل إلى الأنسجة القاعدية اغمس الجزء السابق فى محاليل التعقيم ثم اغسلها بالماء المقطر للتخلص من آثار الكلور وانقل القمة النامية على سطح البيئة ثم عقم فوهة الأنبوبة قبل إغلاقها.

2. ضع الأنابيب فى الحضانة على درجة حرارة 25- 27 م وإضاءة قدرها 100 قدم / شمعه لمدة 16 ساعة يومياً .

3. بعد 4-6 أسابيع انقل النموات الناضجة على بيئة طازجة لها نفس التركيب السابق.

4. عندما يؤدى الـ Sub culture إلى تكوين العديد من الـ Shoots تقسم وتنقل كل Shoot على حدى وتزرع مرة أخرى على انفراد على نفس التركيزات السابقة من الهرمونات

5. انقل النموات الخضرية على بيئة التجذير تحتوى على نصف قوة تركيز الأملاح لبيئة M & S بالإضافة إلى الأكسين فقط بتركيز 0.5 مليجرام / لتر وعادة يضاف IBA أو NAA.

6. تنقل النباتات الناتجة تحت شدة إضاءة عالية 1000 قدم / شمعة لتقسيتها قبل نقلها إلى الأصص وزراعتها تحت ال استعداداً لنقلها إلى المشتل

الدروس العملية فى مجال التكاثر الخضرى بزراعة الأنسجة

1 الدروس العملية فى مجال التكاثر الخضرى بزراعة الأنسجة الأحد مارس 20, 2011 9:46 pm

frid